1、范圍

    本文件規(guī)定了蜂蜜中葫蘆巴堿含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。

    本文件適用于蜂蜜中葫蘆巴堿含量的測定。

 

2、規(guī)范性引用文件

    下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

    GBTT6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

 

3、術(shù)語和定義

    本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

 

4 原理

    試樣用 0.1%甲酸溶液溶解，其中葫蘆巴堿經(jīng)陽離子固相萃取柱提取凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標(biāo)法定量。

 

5 試劑和材料

    除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合GBIT6682規(guī)定的一級水。

 

5.1 試劑

5.1.1 甲酸(CHzOz):色譜純。

5.1.2 甲醇(CHOH):色譜純。

5.1.3 氨水(NH3HzO)

5.1.4 乙腈(CHCN):色譜純。

5.1.5 乙酸銨(CHCOONH):色譜純。

5.2 溶液配制

5.2.1 0.1%甲酸溶液:取1mL甲酸(5.1.1)于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。

5.2.2 2%氨水甲醇溶液:取2mL氨水(5.1.3)于100mL容量瓶中，用甲醇(5.1.2)定容至刻度，混勻。

5.2.3 80%甲醇水溶液:取80mL甲醇(5.1.2)于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。5.2.45mmol/L乙酸銨溶液:稱取0.385g乙酸銨(5.1.5)于1000mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。

5.3 標(biāo)準(zhǔn)品

 

5.3.1 葫蘆巴堿(Trigonelline，CHNO2，CAS號:535-83-1，純度>99%)。

 

5.3.2 葫蘆巴堿-d3(Trigonelline-d3，CHDNOz，純度>98%)

5.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

5.4.1 葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1mg/mL):準(zhǔn)確稱取葫蘆巴堿(5.3.1)標(biāo)準(zhǔn)品 10mg(精確至 0.01 mg)，置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解、稀釋并定容，混勻，配制成濃度為1 mg/mL的葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液，2~8℃C條件下保存，有效期6個月。

5.4.2 葫蘆巴堿-d儲備液(1mg/mL):準(zhǔn)確稱取葫蘆巴堿-d3(5.3.2)標(biāo)準(zhǔn)品10mg(精確至 0.01mg)，置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解、稀釋并定容，混勻，配制成濃度為1mg/mL 的葫蘆巴堿-dg儲備液，2~8℃℃條件下保存。

5.4.3 葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)中間溶液:準(zhǔn)確移取葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液(5.4.1)100，于10mL 容量瓶中，用80%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋并定容，混勻后配制成濃度為10ug/mL的葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，2-8℃條件下保存，有效期3個月。

5.4.4 葫蘆巴堿-d,中間溶液:準(zhǔn)確移取葫蘆巴堿-d3標(biāo)準(zhǔn)儲備液(5.4.2)100，于10mL 容量瓶中,用 80%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋并定容,混勻后配制成濃度為10μg/mL 的葫蘆巴堿-dg中間溶液,2~8℃條件下保存。

5.4.5 葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別移取葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(5.4.3)10mL、20 mL、50 μL、100μL、200 μL、500μL至 10 mL容量瓶中，并分別加入 100μL葫蘆巴堿-d,中間溶液(5.4.4)，用 80%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋至刻度,分別配制成濃度為 0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL,的葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(葫蘆巴堿-d,濃度均為0.1 Hg/mL)，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.5 材料

5.5.1 強陽離子固相萃取柱:60mg/3 mL，或相當(dāng)者。

5.5.2 微孔濾膜:有機系，規(guī)格0.22 mm。

 

6 儀器和設(shè)備

6.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源

6.2 分析天平:感量0.01g和 0.000019

6.3 渦旋混合器。

6.4 固相萃取裝置。

6.5 氮吹儀。

6.6 容量瓶:10mL、50 mL、100 mL、1000 mL。

 

7 試樣制備與保存

7.1 試樣的制備

 

    對無結(jié)晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過60℃℃的水浴中溫?zé)幔袷?，待樣品全部融化后攪勻，冷卻至室溫。分出200g作為試樣。制備好的試樣置于樣品瓶中，密封，并做上標(biāo)記。

 

7.2 試樣的保存

試樣于常溫下保存。

 

8 測定步驟

 

8.1 提取

稱取蜂蜜樣品2g(精確至0.01g)至燒杯中，加入適量0.1%甲酸溶液溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用0.1%甲酸溶液沖洗燒杯兩次并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，定容，混勻。含量超出線性范圍的樣品需適當(dāng)倍數(shù)稀釋。然后取 1.0mL溶液于樣品瓶中，向其中加入 10L 葫蘆巴堿-dg中間溶液(5.4.4)，混勻后待固相萃取凈化。

 

8.2 凈化

強陽離子固相萃取柱(5.5.1)依次用3mL甲醇活化和3mL水平衡，上述加入內(nèi)標(biāo)的提取液上樣至固相萃取柱，依次用3mL水和3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL2%氨水甲醇溶液(5.2.2)洗脫。收集洗脫液，50“條件下氮氣吹干。加入80%甲醇水溶液(5.2.3)1mL，渦旋1min 溶解殘余物，微孔濾膜(5.5.2)過濾，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

8.3 測定

8.3.1 液相色譜參考條件

a)色譜柱:HILIC柱(2.1mmx100mm，1.7m)，或相當(dāng)者:

 

b)流動相:A相為乙腈(5.1.4)，B相為5mmol/L乙酸銨溶液(5.2.4)，梯度洗脫條件見表 1:

 

c)流速:0.3mL/min;

 

d)柱溫:40℃℃:

 

e)進樣量:2μL。

表1梯度洗脫條件(A:乙腈;B:5mmol/L乙酸銨溶液)

 

時間/min	流速（mL/min）	A（%）	B（%）
0	0.3	90	10
0.5	0.3	90	10
1.5	0.3	90	50
3.5	0.3	90	50
4.0	0.3	90	10
6.0	0.3	90	10

 

8.3.2 質(zhì)譜參考條件

 

a)離子源:電噴霧離子源(ESI);

 

    b)掃描方式:正離子掃描;

    c)檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d:的MRM 參數(shù)見表2:

    d)離子源溫度:120℃C;

    e)脫溶劑溫度:350℃C:

    f)脫溶劑氣體流速:650 L/h;g)毛細管電壓:3kV。

表2葫蘆巴堿及葫蘆巴堿-d的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)參數(shù)

 

化合物名稱	定性離子對（m/z）	定量離子對（m/z）	錐孔電壓（V）	碰撞能量（eV）
葫蘆巴堿	138.0/78.0	138.0/92.0	50	22
	138.0/92.0			20
葫蘆巴堿-d3	141.0/97.1	141.0/95.1	50	20
	141.0/95.1			20

 

 

8.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定

 

8.4.1 定性確證

    每種被測組分選擇一個母離子，兩個及以上子離子，在相同實驗條件下，試樣溶液中葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)組分的保留時間一致，相對偏差在22.5%之內(nèi)，所有離子對都出現(xiàn)，且相對離子豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液相對離子豐度一致，其允許偏差應(yīng)符合表3的要求。

 

表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

 

相對離子豐富度	>50%	>20%~50%	>10%~20%	≤10%
最大允許偏差	±20%	±25%	±30%	±50%

 

8.4.2 定量測定

    按照8.3.1和8.3.2設(shè)定儀器條件，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按內(nèi)標(biāo)法計算試樣中目標(biāo)物的含量。標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中的目標(biāo)物響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。

8.5 平行試驗

    按以上步驟，對同一試樣進行平行試驗測定。

 

8.6 空白試驗

    除不稱取樣品外，均按上述相同條件和步驟進行。

 

 

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