GH/T 1452-2024 蜂蜜中葫蘆巴堿含量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
1、范圍
本文件規定了蜂蜜中葫蘆巴堿含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本文件適用于蜂蜜中葫蘆巴堿含量的測定。
2、規范性引用文件
下列文件中的內容通過(guò)文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GBTT6682分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法
3、術(shù)語(yǔ)和定義
本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。
4 原理
試樣用 0.1%甲酸溶液溶解,其中葫蘆巴堿經(jīng)陽(yáng)離子固相萃取柱提取凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,內標法定量。
5 試劑和材料
除另有規定外,所有試劑均為分析純,水為符合GBIT6682規定的一級水。
5.1 試劑
5.1.1 甲酸(CHzOz):色譜純。
5.1.2 甲醇(CHOH):色譜純。
5.1.3 氨水(NH3HzO)
5.1.4 乙腈(CHCN):色譜純。
5.1.5 乙酸銨(CHCOONH):色譜純。
5.2 溶液配制
5.2.1 0.1%甲酸溶液:取1mL甲酸(5.1.1)于1000mL容量瓶中,用水定容至刻度,混勻。
5.2.2 2%氨水甲醇溶液:取2mL氨水(5.1.3)于100mL容量瓶中,用甲醇(5.1.2)定容至刻度,混勻。
5.2.3 80%甲醇水溶液:取80mL甲醇(5.1.2)于100mL容量瓶中,用水定容至刻度,混勻。5.2.45mmol/L乙酸銨溶液:稱(chēng)取0.385g乙酸銨(5.1.5)于1000mL容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混勻。
5.3 標準品
5.3.1 葫蘆巴堿(Trigonelline,CHNO2,CAS號:535-83-1,純度>99%)。
5.3.2 葫蘆巴堿-d3(Trigonelline-d3,CHDNOz,純度>98%)
5.4 標準溶液配制
5.4.1 葫蘆巴堿標準儲備液(1mg/mL):準確稱(chēng)取葫蘆巴堿(5.3.1)標準品 10mg(精確至 0.01 mg),置于 10 mL 容量瓶中,加入甲醇溶解、稀釋并定容,混勻,配制成濃度為1 mg/mL的葫蘆巴堿標準儲備液,2~8℃C條件下保存,有效期6個(gè)月。
5.4.2 葫蘆巴堿-d儲備液(1mg/mL):準確稱(chēng)取葫蘆巴堿-d3(5.3.2)標準品10mg(精確至 0.01mg),置于 10 mL 容量瓶中,加入甲醇溶解、稀釋并定容,混勻,配制成濃度為1mg/mL 的葫蘆巴堿-dg儲備液,2~8℃℃條件下保存。
5.4.3 葫蘆巴堿標準中間溶液:準確移取葫蘆巴堿標準儲備液(5.4.1)100,于10mL 容量瓶中,用80%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋并定容,混勻后配制成濃度為10ug/mL的葫蘆巴堿標準中間溶液,2-8℃條件下保存,有效期3個(gè)月。
5.4.4 葫蘆巴堿-d,中間溶液:準確移取葫蘆巴堿-d3標準儲備液(5.4.2)100,于10mL 容量瓶中,用 80%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋并定容,混勻后配制成濃度為10μg/mL 的葫蘆巴堿-dg中間溶液,2~8℃條件下保存。
5.4.5 葫蘆巴堿標準工作溶液:分別移取葫蘆巴堿標準中間溶液(5.4.3)10mL、20 mL、50 μL、100μL、200 μL、500μL至 10 mL容量瓶中,并分別加入 100μL葫蘆巴堿-d,中間溶液(5.4.4),用 80%甲醇水溶液(5.2.3)稀釋至刻度,分別配制成濃度為 0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL,的葫蘆巴堿標準工作溶液(葫蘆巴堿-d,濃度均為0.1 Hg/mL),用于繪制標準工作曲線(xiàn)。標準工作溶液現用現配。
5.5 材料
5.5.1 強陽(yáng)離子固相萃取柱:60mg/3 mL,或相當者。
5.5.2 微孔濾膜:有機系,規格0.22 mm。
6 儀器和設備
6.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源
6.2 分析天平:感量0.01g和 0.000019
6.3 渦旋混合器。
6.4 固相萃取裝置。
6.5 氮吹儀。
6.6 容量瓶:10mL、50 mL、100 mL、1000 mL。
7 試樣制備與保存
7.1 試樣的制備
對無(wú)結晶的蜂蜜樣品,將其攪拌均勻。對有結晶的樣品,在密閉情況下,置于不超過(guò)60℃℃的水浴中溫熱,振蕩,待樣品全部融化后攪勻,冷卻至室溫。分出200g作為試樣。制備好的試樣置于樣品瓶中,密封,并做上標記。
7.2 試樣的保存
試樣于常溫下保存。
8 測定步驟
8.1 提取
稱(chēng)取蜂蜜樣品2g(精確至0.01g)至燒杯中,加入適量0.1%甲酸溶液溶解并轉移至50mL容量瓶中,用0.1%甲酸溶液沖洗燒杯兩次并轉移至容量瓶中,定容,混勻。含量超出線(xiàn)性范圍的樣品需適當倍數稀釋。然后取 1.0mL溶液于樣品瓶中,向其中加入 10L 葫蘆巴堿-dg中間溶液(5.4.4),混勻后待固相萃取凈化。
8.2 凈化
強陽(yáng)離子固相萃取柱(5.5.1)依次用3mL甲醇活化和3mL水平衡,上述加入內標的提取液上樣至固相萃取柱,依次用3mL水和3mL甲醇淋洗,抽干,用3mL2%氨水甲醇溶液(5.2.2)洗脫。收集洗脫液,50“條件下氮氣吹干。加入80%甲醇水溶液(5.2.3)1mL,渦旋1min 溶解殘余物,微孔濾膜(5.5.2)過(guò)濾,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
8.3 測定
8.3.1 液相色譜參考條件
a)色譜柱:HILIC柱(2.1mmx100mm,1.7m),或相當者:
b)流動(dòng)相:A相為乙腈(5.1.4),B相為5mmol/L乙酸銨溶液(5.2.4),梯度洗脫條件見(jiàn)表 1:
c)流速:0.3mL/min;
d)柱溫:40℃℃:
e)進(jìn)樣量:2μL。
表1梯度洗脫條件(A:乙腈;B:5mmol/L乙酸銨溶液)
時(shí)間/min | 流速(mL/min) | A(%) | B(%) |
0 | 0.3 | 90 | 10 |
0.5 | 0.3 | 90 | 10 |
1.5 | 0.3 | 90 | 50 |
3.5 | 0.3 | 90 | 50 |
4.0 | 0.3 | 90 | 10 |
6.0 | 0.3 | 90 | 10 |
8.3.2 質(zhì)譜參考條件
a)離子源:電噴霧離子源(ESI);
b)掃描方式:正離子掃描;
c)檢測方式:多反應監測(MRM),葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d:的MRM 參數見(jiàn)表2:
d)離子源溫度:120℃C;
e)脫溶劑溫度:350℃C:
f)脫溶劑氣體流速:650 L/h;g)毛細管電壓:3kV。
表2葫蘆巴堿及葫蘆巴堿-d的多反應監測(MRM)參數
化合物名稱(chēng) | 定性離子對(m/z) | 定量離子對(m/z) | 錐孔電壓(V) | 碰撞能量(eV) |
葫蘆巴堿 | 138.0/78.0 | 138.0/92.0 | 50 | 22 |
138.0/92.0 | 20 | |||
葫蘆巴堿-d3 | 141.0/97.1 | 141.0/95.1 | 50 | 20 |
141.0/95.1 | 20 |
8.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定
8.4.1 定性確證
每種被測組分選擇一個(gè)母離子,兩個(gè)及以上子離子,在相同實(shí)驗條件下,試樣溶液中葫蘆巴堿和葫蘆巴堿-d的保留時(shí)間與標準溶液中相應組分的保留時(shí)間一致,相對偏差在22.5%之內,所有離子對都出現,且相對離子豐度與濃度相當的標準溶液相對離子豐度一致,其允許偏差應符合表3的要求。
表3定性確證時(shí)相對離子豐度的最大允許偏差
相對離子豐富度 | >50% | >20%~50% | >10%~20% | ≤10% |
最大允許偏差 | ±20% | ±25% | ±30% | ±50% |
8.4.2 定量測定
按照8.3.1和8.3.2設定儀器條件,以目標物的質(zhì)量濃度為橫坐標,以目標物峰面積與同位素內標峰面積比值為縱坐標,繪制標準工作曲線(xiàn),按內標法計算試樣中目標物的含量。標準溶液及試樣溶液中的目標物響應值均應在儀器檢測的線(xiàn)性范圍內。
8.5 平行試驗
按以上步驟,對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定。
8.6 空白試驗
除不稱(chēng)取樣品外,均按上述相同條件和步驟進(jìn)行。
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