１、范圍

 

    本文件規定了畜禽肉中色胺、βＧ苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚(yú)胺、酪胺、亞精胺和精胺的液相色譜Ｇ串聯(lián)質(zhì)譜測定方法.

 

    本文件適用于豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、鴨肉和鵝肉中色胺、βＧ苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、章魚(yú)胺、酪胺、亞精胺和精胺的測定.

 

 

 

２、規范性引用文件

 

    下列文件中的內容通過(guò)文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款.其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件.

 

    GB/T６６８２分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法

 

 

３、術(shù)語(yǔ)和定義

 

    本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義.

 

 

４、原理

 

    試樣中的生物胺用５％三氯乙酸溶液提取,正己烷除脂,經(jīng)丹磺酰氯衍生,液相色譜Ｇ串聯(lián)質(zhì)譜儀測定,內標法定量.

 

 

５試劑或材料

 

    除非另有規定,在分析中僅使用分析純試劑,水為符合GB/T６６８２規定的一級水.

 

５.１試劑

 

５.１.１ 乙腈(CH３CN):色譜純.

 

５.１.２ 三氯乙酸(CCl３COOH).

 

５.１.３ 丙酮(CH３COCH３):色譜純.

 

５.１.４ 正己烷(C６H１４):色譜純.

 

５.１.５ 濃氨水(NH３?H２O).

 

５.１.６ 碳酸氫鈉(NaHCO３).

 

５.１.７ 碳酸鈉(Na２CO３).

 

５.１.８ 氫氧化鈉(NaOH).

 

５.１.９ 濃鹽酸(HCl):１２mol/L,優(yōu)級純.

 

５.１.１０ 丹磺酰氯(C１２H１２ClNO２S):純度＞９９％.

 

５.１.１１ 乙酸乙酯(CH３CH２OOCCH３):色譜純.

 

５.１.１２ 甲酸(HCOOH).

 

５.２ 溶液的配制

 

５.２.１ 三 氯乙酸溶液(５％):稱(chēng)?。保癵三氯乙酸于２５０mL錐形瓶中,加２００mL水,超聲充分溶解.

 

５.２.２ 氫氧化鈉溶液(１mol/L):稱(chēng)?。磄氫氧化鈉,加１００mL水溶解.

 

５.２.３ 碳酸鈉Ｇ碳酸氫鈉緩沖溶液:稱(chēng)?。保?７g碳酸鈉以及１g碳酸氫鈉于５００mL錐形瓶中,加３００mL１NY/T４４３８—２０２３水溶解,用１mol/LNaOH溶液(５.２.２)調節pH至１１.５.

 

５.２.４ 丹磺酰氯丙酮溶液(１０mg/mL):準確稱(chēng)?。保埃癿g丹磺酰氯于１５mL離心管中,加１０mL丙酮(５.１.３)溶解,臨用現配.

 

５.２.５ 鹽酸溶液(０.１mol/L):在８００mL水中加８.３mL濃鹽酸(５.１.９),加水至１０００mL.

 

５.２.６ 甲酸溶液(０.１％):在８００mL水中加１.０mL甲酸(５.１.１２),加水至１０００mL.

 

５.３ 標準品

 

    ９種生物胺和２種同位素內標物標準品:純度≥９７％,中英文名稱(chēng)、CAS號和分子式見(jiàn)附錄A.

 

５.４ 標準溶液的制備

 

５.４.１ 混合標準儲備溶液(１０mg/mL):分別稱(chēng)取各１００mg(以生物胺的單體計,精確至０.１mg)９種生物胺標準品,用０.１mol/L鹽酸溶液(５.２.５)溶解并定容至１０mL棕色容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為１０mg/mL的混合標準儲備溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期６個(gè)月.

 

５.４.２ 混合標準工作溶液(１mg/mL):準確移取混合標準儲備溶液(５.４.１)１mL于１０mL棕色容量瓶中,用０.１mol/L鹽酸溶液(５.２.５)定容,配制成濃度為１mg/mL的混合標準工作溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期３個(gè)月.

 

５.４.３ 混合同位素內標儲備溶液(０.１mg/mL):分別稱(chēng)?。卜N生物胺同位素內標物標準品１mg(精確至０.１mg),用０.１mol/L鹽酸溶液(５.２.５)溶解并定容至１０mL棕色容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為０.１mg/mL的混合同位素內標儲備溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期６個(gè)月.

 

５.４.４ 混合同位素內標工作溶液(１μg/mL):準確移取混合同位素內標儲備溶液(５.４.３)０.１mL于１０mL棕色容量瓶中,用０.１mol/L鹽酸溶液(５.２.５)定容,配制成濃度為１μg/mL的混合同位素內標工作溶液,于－１８°C以下避光保存,有效期３個(gè)月.

 

５.５ 材料

 

５.５.１ 陶瓷均質(zhì)子.

 

５.５.２ 微孔濾膜:０.２２μm,有機系.

 

 

６、儀器設備

 

６.１ 液相色譜Ｇ串聯(lián)質(zhì)譜儀:配有電噴霧離子源(ESI).

 

６.２ 天平:感量０.０１g和０.００００１g.

 

６.３ pH計.

 

６.４ 渦旋振蕩器.

 

６.５ 往復式振蕩器.

 

６.６ 離心機:轉速≥８０００r/min.

 

６.７ 恒溫水浴振蕩器.

 

６.８ 氮吹儀.

 

 

 

７、試樣的制備與保存

 

７.１ 試樣制備取適量剛屠宰后新鮮的空白供試樣品,絞碎,并使均質(zhì).

 

    a)取均質(zhì)后的供試樣品,作為供試試樣;

 

    b)取均質(zhì)后的空白樣品,作為空白試樣;

 

    c)取均質(zhì)后的空白樣品,添加適宜濃度的混合標準工作溶液,作為空白添加試樣.

 

７.２ 試樣保存－１８°C以下保存.

 

 

８、測定步驟

 

８.１ 提取凈化

 

    稱(chēng)?。礸試樣(精確至±０.０５g)于５０mL具塞離心管中,加２粒陶瓷均質(zhì)子,加０.２５mL混合同位素內標工作溶液(５.４.４)和１５mL５％三氯乙酸溶液(５.２.１),加蓋渦旋振蕩３０s,用往復式振蕩器振蕩提?。保祄in,于不低于８０００r/min下離心１０min,上清液轉移至５０mL容量瓶中.殘渣用１５mL５％三氯乙酸溶液(５.２.１)重復提?。贝?合并上清液,混勻,用５％三氯乙酸溶液(５.２.１)定容至刻度.準確移取上述溶液１０mL于５０mL具塞離心管中,加１０mL正己烷(５.１.４),加蓋渦旋振蕩５min,于不低于５０００r/min離心５min.棄去上層有機相,向下層水相中加１０mL正己烷(５.１.４)重復提?。贝?合并下層水相作為待衍生溶液.

 

８.２ 衍生

 

    準確移?。?０mL待衍生溶液,置于１０mL具塞離心管中,加１mLpH１１.５的碳酸鈉Ｇ碳酸氫鈉緩沖溶液(５.２.３),渦旋混勻１min,加１mL１０mg/mL的丹磺酰氯丙酮溶液(５.２.４),立即加蓋渦旋混勻１min后,置于恒溫水浴振蕩器上于６０°C水浴下避光振蕩１５min.加０.１mL濃氨水(５.１.５),渦旋混勻３０s,靜置１５min冷卻至室溫,加３mL乙酸乙酯(５.１.１１)渦旋振蕩１min,吸取上層有機相于另一１０mL具塞離心管中,下層水相用３mL乙酸乙酯(５.１.１１)重復提?。贝?合并２次有機相,在４０°C水浴下氮氣吹干,準確加１.０mL乙腈(５.１.１)溶解殘渣,渦旋混勻,過(guò)０.２２μm濾膜后供液相色譜Ｇ串聯(lián)質(zhì)譜儀測定.

 

８.３ 標準曲線(xiàn)的制備

 

    準確移取混合標準工作溶液(５.４.２)和混合同位素內標工作溶液(５.４.４)適量,用１５mL５％三氯乙酸溶液(５.２.１)稀釋,配制成生物胺濃度分別為１.０μg/mL、２.０μg/mL、１０μg/mL、５０μg/mL和２００μg/mL(２種同位素內標濃度均為５μg/L)的系列溶液,按照８.２步驟進(jìn)行衍生反應,得到質(zhì)量濃度為１.０μg/mL、２.０μg/mL、１０μg/mL、５０μg/mL和２００μg/mL的系列標準溶液(２種同位素內標濃度均為５μg/L),供液相色譜Ｇ串聯(lián)質(zhì)譜儀測定.以標準物特征離子色譜峰的峰面積與同位素內標物特征離子色譜峰的峰面積比值為縱坐標、相應的標準溶液濃度為橫坐標,繪制標準工作曲線(xiàn),求回歸方程和相關(guān)系數.

 

８.４、測定步驟

 

８.４.１  液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下:

 

    a)色譜柱:C１８柱(１００mm×２.１mm,粒徑２.７μm),或相當者;

 

    b)流動(dòng)相:乙腈(５.１.１)和０.１％甲酸溶液(５.２.６),梯度洗脫條件見(jiàn)表１;

 

    c)流速:０.３mL/min;d)柱溫:３０°C;

 

    e)進(jìn)樣量:２μL.

 

表１液相色譜梯度洗脫條件