1  范圍

 

     本文件規定了葡萄中赭曲霉毒素A的高效液相色譜測定方法。

 

    本文件適用于葡萄中赭曲霉毒素A的測定。

 

 

 

 

2  規范性引用文件

 

    下列文件中的條款通過(guò)本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注明日期的引用文件，僅注明日期的版本適用于本標準。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

 

    GB5009.96-2016食品安全國家標準食品中赭曲霉毒素A的測定

 

    GB23200.121-2021食品安全國家標準植物源性食品中331種農藥及其代謝物殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

 

    GB/T6682-2008分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法

 

 

 

3  原理、定義和先進(jìn)性

 

3.1  原理和定義

 

     QuEChERS方法：利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化目的的前處理方法。試樣用乙腈提取，然后使用萃取鹽液液分層，采用分散固相萃取，使用石墨粉等吸附劑進(jìn)行凈化，取上層液進(jìn)行高效液相色譜檢測，外標法定量。

 

3.2  先進(jìn)性

 

    （1）回收率高；（2）精確度和準確度高；（3）可分析的物質(zhì)范圍廣；（4）分析速度快；（5）溶劑使用量少，污染小，價(jià)格低廉且不使用含氯化物溶劑；（6）操作簡(jiǎn)便，無(wú)需良好訓練和較高技能便可很好地完成；（7）乙腈加到容器后立即密封，使其與工作人員的接觸機會(huì )減少；（8）樣品制備過(guò)程中僅使用很少的玻璃器皿，裝置簡(jiǎn)單。

 

 

4  試劑和材料

 

4.1  試劑

 

    乙腈（色譜級）。

 

    甲酸（色譜級）。

    氯化鈉（NaCl）。

 

    無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）。

 

    石墨粉（CAS:7782-42-5），純度≥99.8%。

 

    注：除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。

 

4.2  標準品

 

    赭曲霉毒素A（C20H18ClNO6,CAS號：303-47-9），純度≥99%。

 

4.3  標準溶液配制

 

    取赭曲霉毒素A標準品1.0mg置于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成濃度為100mg/L的赭曲霉毒素A標準溶液，4°C下避光保存。

 

 

5  儀器和設備

 

5.1  液相色譜儀

 

    配有熒光檢測器（FLD）。

 

5.2  離心機

 

    轉速不低于12000r/min。

 

5.3  電子天平

 

    感量0.1mg和0.01g。

 

 

6  分析步驟

 

6.1  試樣制備、提取與凈化

 

6.1.1  試樣制備

 

    樣品測定部位按照GB2763-2021中附錄A的規定執行。稱(chēng)取10.0g經(jīng)料理機破碎的葡萄樣品置于50mL離心管。

 

6.1.2  提取

 

    加入10mL乙腈（1%甲酸），手動(dòng)震蕩1min，再依次加入1.0g氯化鈉、4.0g無(wú)水硫酸鎂，手動(dòng)震蕩1min，在8000r/min離心5min。

 

6.1.3  凈化

 

    取1mL6.1.2  部分上清液移入另一裝有150mg無(wú)水硫酸鎂和80mg石墨粉的2mL離心管中，手動(dòng)震蕩1min，12000r/min離心5min，用1mL注射器抽取上清液過(guò)0.22μm濾膜，待HPLC檢測。

 

6.2  試樣測定

 

6.2.1  高效液相色譜條件

 

    C18色譜柱（3.0mm×150mm，2.7μm），或相當者；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈；采用梯度洗脫，流速0.50mL/min；柱溫30°C；進(jìn)樣量10μL；檢測器FLD，激發(fā)波長(cháng)Ex：334nm，發(fā)射波長(cháng)Em：460nm。

 

    梯度洗脫程序：0min～5min：流動(dòng)相A：50%，流動(dòng)相B：50%，流量為0.5mL/min；5min～10min：流動(dòng)相A：30%，流動(dòng)相B：70%，流量為0.5mL/min；10min～15min：流動(dòng)相A：10%，流動(dòng)相B：90%，流量為0.5mL/min；15min～18min：流動(dòng)相A：50%，流動(dòng)相B：50%，流量為0.5mL/min。

 

6.2.2  基質(zhì)匹配標準工作曲

 

    線(xiàn)選擇與被測樣品性質(zhì)相同或相似的空白樣品，按照步驟6.1  部分進(jìn)行前處理，得到空白基質(zhì)溶液。準確移取一定量的赭曲霉毒素A標準儲備液（4.3部分）用空白基質(zhì)溶液稀釋?zhuān)謩e配成相當于1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的基質(zhì)匹配標準工作液，供高效液相色譜儀測定。以赭曲霉毒素A的色譜圖峰面積為縱坐標，相對應的基質(zhì)匹配標準工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，繪制基質(zhì)匹配標準工作曲線(xiàn)。

 

6.2.3  色譜測定

 

   在6.2.1  色譜條件下，將基質(zhì)匹配標準工作溶液按濃度從低到高依次注入高效液相色譜儀，以赭曲霉毒素A的濃度（x，μg/L）為橫坐標，對應色譜峰峰面積（y）為縱坐標，進(jìn)行回歸計算，繪制基質(zhì)匹配標準工作曲線(xiàn)，基質(zhì)匹配標準工作曲線(xiàn)按式（1）計算：

 

y=ax+b................................................................................(1)

 

    式中：

 

    y—赭曲霉毒素A的峰面積；

 

    a—基質(zhì)匹配標準工作曲線(xiàn)斜率；

 

    x—赭曲霉毒素A的濃度，μg/L；

 

    b—基質(zhì)匹配標準工作曲線(xiàn)截距。

 

6.2.4  定性和定量

 

6.2.4.1  定性

 

    保留時(shí)間，被測試樣中赭曲霉毒素A的色譜峰的保留時(shí)間與相應標準色譜峰的保留時(shí)間相比較，相對誤差應在±2.5%之內。

 

6.2.4.2  定量

 

    外標法，指按梯度添加一定量的標準品(對照品)于空白溶劑中制成對照樣品，與未知試樣平行地進(jìn)行樣品處理并檢測。不同濃度的標準品進(jìn)樣，以峰面積為值繪制成標準曲線(xiàn)，從而推算出未知試樣中被測組分濃度的定量方法。相對誤差應在±1%之內。

 

6.2.5  試樣溶液的測定

 

    將基質(zhì)匹配標準溶液和試樣溶液依次注入高效液相色譜儀中，待測樣液中赭曲霉毒素A的響應值應在儀器檢測的定量測定線(xiàn)性范圍之內，超過(guò)線(xiàn)性范圍時(shí)應根據測定濃度進(jìn)行適當倍數稀釋后再進(jìn)行分析。

 

6.2.6  平行試驗

 

    按以上步驟對同一試樣進(jìn)行平行試驗測定。

 

6.2.7  空白試驗

 

    除不加試樣外，采用完全相同的測定步驟進(jìn)行平行操作。

 

 

7  結果計算

 

    試樣中赭曲霉毒素A含量以質(zhì)量分數計，單位為μg/kg，按公式（2）計算。

 

 

    ω—試樣中被測物的數值，μg/kg；

 

    ρ—從基質(zhì)匹配標準工作溶液中得到的試樣溶液中被測物的質(zhì)量濃度的數值，μg/L；

 

    V—提取液體積的數值，mL；

 

    m—試樣質(zhì)量的數值，g；

 

    計算結果以重復性條件下獲得的至少3次獨立測定結果的算術(shù)平均值表示，保留2位有效數字。

 

 

8  精密度和添加回收率

 

    樣品中赭曲霉毒素A含量在重復性條件下獲得的3次獨立測試結果的絕對差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的5%，參見(jiàn)附錄A。

 

 

9  檢出限

 

    以3倍的信噪比作為方法檢出限，本方法的檢出限為0.046±0.001μg/kg，參見(jiàn)附錄B。

 

附錄（資料性附錄）

 

附錄A

 

赭曲霉毒素A測定方法的精密度和添加回收率

 

加標水平，μg/kg	添加回收率，%			精密度，%
	葡萄1	葡萄2	葡萄3	葡萄1	葡萄2	葡萄3
1.5	87.4	101.8	104.9	3.7	3.3	3.4
15	96.4	108.3	99.6	4.5	3.2	3.9
40	95.9	100.4	100.5	3.4	3.5	4.0

 

 

 

附錄B

 

毒素的英文名稱(chēng)和葡萄基質(zhì)中的方法檢出限

 

中文名	英文名	方法檢出限，μg/kg
赭曲霉毒素A	Ochratoxin A	0.046	0.047	0.045

 

 

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