1、范圍

 

    本文件規定了甘蔗中的3-硝基丙酸的液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜測定方法。

 

    本文件適用于甘蔗中3-硝基丙酸含量的測定。

 

2、規范性引用文件

 

    下列文件中的內容通過(guò)文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

 

    GB/T6682分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法

 

    GB/T27404實(shí)驗室質(zhì)量控制規范食品理化檢測

 

3、術(shù)語(yǔ)和定義本

 

文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

 

4、原理

 

 

 

 

利用乙腈振蕩提取甘蔗樣品中3-硝基丙酸（3-NPA），提取液離心過(guò)濾，上清液經(jīng)乙二胺-N-丙基（PSA）固相萃取柱凈化濃縮后，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定目標物，結果通過(guò)外標法進(jìn)行定量。5試劑和材料除非另有說(shuō)明，本文件所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。

 

5、試劑和材料

 

5.1.1  乙腈（C2H3N）：色譜純。

 

5.1.2  甲醇（CH3OH）：色譜純。

 

5.1.3  甲酸（CH2O2）：色譜純。

 

5.1.4  氨水（NH4OH）。試劑配制5.2.11%氨水-甲醇溶液：吸取1.0mL氨水，用甲醇稀釋至100mL，混勻。

 

5.2.2  0.5%甲酸水溶液：吸取5.0mL甲酸，用水稀釋至1000mL，混勻。標準品3-硝基丙酸（3-NPA，C8H5NO6，CAS：603-11-2）：純度≥97.0%。標準溶液配制

 

5.4.1  標準儲備液（100μg/mL）：稱(chēng)取3-硝基丙酸標準品0.01g（精確到0.0001g），用乙腈溶解后轉移至100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成質(zhì)量濃度為100μg/mL的標準儲備液，于-20°C條件下保存，有效期三個(gè)月。

 

5.4.2  標準使用液（1.00μg/mL）：準確量取標準儲備液1.0mL至100mL容量瓶，用乙腈定容，配制成1.00μg/mL的標準使用液，臨用時(shí)配制。

 

5.5  材料

 

5.5.1  乙二胺-N-丙基（PSA）固相萃取柱：3cc，500mg，或其他等效柱。

 

5.5.2  定性分析濾紙。

 

5.5.3  微孔濾膜：0.2μm，水相。

 

 

6、儀器和設備

 

a)電子天平：感量為0.001g，0.0001g。

 

b)渦旋混勻器。

 

c)震蕩器。

 

d)離心機：轉速≥8000r/min。

 

e)研磨機。

 

f)氮吹儀。

 

g)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀：配備電噴霧離子源ESI。

 

 

7、析步驟

 

7.1  試樣制備

 

    甘蔗切塊，研磨機研磨打碎，4°C保存，盡快處理。如發(fā)現甘蔗有顏色異常、質(zhì)地發(fā)軟等霉變現象，可針對霉變部分單獨取樣。

 

7.2  試樣的提取和凈化

 

    稱(chēng)取2g（精確到0.001g）制備好的樣品于50mL離心管中，管中加入20mL乙腈后利用渦旋混勻器混勻。將離心管放置于與震蕩器上振蕩30min后，于8000r/min離心10min，上清液經(jīng)定性濾紙過(guò)濾得到濾液。

 

    PSA固相萃取柱用3mL乙腈活化后，取10mL濾液過(guò)柱,用4mL1%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液于40°C水溫中氮吹至近干，用0.5%甲酸水溶液定容至1.0mL得到待測樣品（下文簡(jiǎn)稱(chēng)樣品），樣品經(jīng)0.2μm水相微孔濾膜過(guò)濾后待測上機。

 

7.3  基質(zhì)加標標準工作曲線(xiàn)溶液的制備

 

    稱(chēng)取7份不含3-NPA的空白甘蔗樣本2g（精確到0.001g）作為基質(zhì)，分別加入1.00μg/mL標準使用液20、40、100、200、400、800、1000μL，并按照7.2節方法進(jìn)行提取和凈化后，制備濃度依次為10.0、20.0、50.0、100、200、400、500ng/mL的系列標準工作曲線(xiàn)溶液。

 

注：根據儀器性能和檢測需要，應制備不少于5個(gè)濃度水平的標準工作曲線(xiàn)溶液。儀器參考條件

 

7.4.  1色譜參考條件

 

7.4.1.1  色譜柱：十八烷基硅烷反相色譜柱（100mm×2.1mm,1.8μm），或者相當者。

 

7.4.1.2  流動(dòng)相：A相，水；B相，乙腈。

 

7.4.1.3  流速：0.3mL/min。

 

7.4.1.4  梯度洗脫：洗脫程序見(jiàn)表1。

 

表1梯度洗脫程序

 

 

時(shí)間/min	流動(dòng)相A/%	甲醇/%
0.0	95	5
2.0	50	50
2.1	10	90
3.0	10	90
3.1	95	5
7.0	95	5

 

7.4.1.5  柱溫：40°C。

 

7.4.1.6  進(jìn)樣量：5.0μL。

 

7.4.2  質(zhì)譜參考條件

 

7.4.2.1  離子源：電噴霧離子源ESI，離子源溫度550°C。

 

7.4.2.2  掃描模式：負離子掃描模式。

 

7.4.2.3  檢測方式：多離子反應監測（MRM）。

 

7.4.2.4  噴霧電壓：-4500V。

 

7.4.2.5源內氣：55psi。

 

7.4.2.6  輔助氣：55psi。

 

 

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