1、范圍

 

    本方法適用于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對氯霉素和甲硝唑抗生素殘留量的同時(shí)測定。

 

    本標準適用于豬、牛、雞、鴨、魚(yú)、蝦、貝類(lèi)中氯霉素和甲硝唑抗生素殘留量的測定。

 

 

 

2、規范性引用文件

 

    下列文件中的內容通過(guò)文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

 

    GB/T5009.1食品衛生檢驗方法理化部分總則

 

    GB/T6682分析實(shí)驗室用水規格和試驗方法GB/T8170數值修約規則與極限數值的表示和判定

 

    GB/T22338-2008動(dòng)物源性食品中氯霉素類(lèi)藥物殘留測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

 

    GB/T27404實(shí)驗室質(zhì)量控制規范食品理化檢測

 

 

3、術(shù)語(yǔ)和定義

 

    本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

 

 

4、原理

 

    采用乙酸乙酯提取試樣中氯霉素和甲硝唑藥物殘留，經(jīng)低溫離心，正己烷除油，氮吹、定容后，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定目標物，內標法定量。

 

 

5、試劑

 

    除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。

 

5.1  乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純。

 

5.2  正己烷（C6H14）：色譜純。

 

5.3  乙腈（C2H3N）：色譜純。

 

5.4  乙酸銨（C2H7NO2）：色譜純。

 

5.5  氫氧化銨（NH3OH，濃度為25%~28%）。

 

5.6  無(wú)水硫酸鈉（Na2SO4）：使用前經(jīng)馬弗爐550°C灼燒2h，冷卻后密封保存。

 

5.7  5mmol/L乙酸銨溶液：稱(chēng)取0.39g乙酸銨，用水稀釋至1000mL，混勻。

 

5.8  氯霉素（C11H12Cl2N2O5，CAS:56-75-7）、D5-氯霉素（C11H7Cl2D5N2O5，CAS:202480-68-0）、甲硝唑（C6H9N3O3，CAS:443-48-1）、D4-甲硝唑（C6H5D4N4O3，CAS:1261392-47-5）標準物質(zhì)：純度≥98%

 

5.9  標準儲備液：1000mg/mL。分別準確稱(chēng)取氯霉素、甲硝唑、D5-氯霉素、D4-甲硝唑標準品10.0mg（按照純度示值折算），用甲醇溶解并定容至10mL，配成1000mg/mL的標準儲備液，-20°C以下避光保存，保存期為12個(gè)月。

 

5.10  混合標準儲備液：分別準確吸取100μL氯霉素、甲硝唑標準儲備液，用甲醇定容至10mL，配成濃度為10mg/L的混合標準儲備液，-20°C以下避光保存，保存期為6個(gè)月。

5.11  混合內標儲備液：分別準確量取100μLD5-氯霉素、D4-甲硝唑標準儲備液，用甲醇定容至10mL，配成10mg/L的混合內標儲備液，-20°C以下避光保存，保存期為6個(gè)月。

 

5.12  標準使用液：準確吸取混合標準儲備液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，標準使用液質(zhì)量濃度為0.05mg/L，4°C保存，保存期為7天。

 

5.13  內標使用液：準確吸取混合內標儲備液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，內標使用液質(zhì)量濃度為0.05mg/L，4°C保存，保存期為7天。

 

1.14  混合標準工作液：分別準確吸取標準使用液5μL、10μL、20μL、50μL、100μL，內標使用液各40μL，用10%乙腈-水溶液定容至1.0mL，配制成氯霉素、甲硝唑含量為0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL標準系列，其中內標濃度為2ng/mL。臨用現配。

 

 

6  儀器

 

6.1  天平：感量為0.01g，0.1mg

 

6.2  組織搗碎機

 

6.3  渦旋混勻器

 

6.4  超聲波清洗器

 

6.5  離心機：≥14000r/min

 

6.6  氮吹儀

 

6.7氮氣發(fā)生器

 

6.8  液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源

 

 

7  試樣制備與保存

 

7.1  試樣的的制備

 

    取樣品約500g用肉類(lèi)組織搗碎機絞碎，裝入潔凈容器作為試樣，密封并標明標記。

 

7.2  試樣的的保存

 

  將試樣于-18°C冰箱中保存。

 

 

8  測定步驟

 

8.1  提取稱(chēng)取5g（精確到0.01g）已經(jīng)均質(zhì)好的樣品于50mL離心管中，加入80μL內標標準使用液、15mL乙酸乙酯、0.5mL氫氧化銨、足量的無(wú)水硫酸鈉，渦旋混勻，超聲提取30min。在14000r/min，5°C下離心15min，將上清液轉移至另一干凈的離心管中，再在樣品管中加入上述試劑，重復提取一次。合并兩次提取的上清液，于50°C氮氣吹干。

 

8.2  凈化將離心管中的殘渣用2mL5%乙腈-水溶液溶解，渦旋30s，超聲1min，加入5mL正己烷，渦旋30s，在14000r/min，5°C離心15min，棄去正己烷，重復操作3次。取水層過(guò)0.22μm的尼龍濾膜，收集濾液待上機。

 

8.3  測定條件

 

8.3.1  液相色譜條件

 

    a)色譜柱：C18(十八烷基硅烷，5μm，2.1×150mm)，或相當者；

 

    b)流動(dòng)相：A相5mmol/L的乙酸銨溶液，B相為乙腈。流速為0.3mL/min，梯度洗脫見(jiàn)表1；表1梯度洗脫程序

 

    c)柱溫：40°C；

 

    d)進(jìn)樣量：5μL。

 

 

圖A.1氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）多反應監測（MRM）色譜圖

 

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